从啤酒发酵废水中提取核糖核酸
许宁，李志富，冯文华
（泰山医学院工程学院，山东 泰安 271000） 摘要：废酵母是啤酒工业废水中的主要污染物。在常温下，用10％的淡盐水，从废酵母中提取核糖核酸和脱核酵母，回收率为3.3％～3.5％和65.2％～66.5％。对提取液进行预处理后，核糖核酸产品纯度大于90％。提取核糖核酸和脱核酵母后废水的BOD5 和CODcr分别下降81％和78％以上。
关键词：啤酒；发酵；废水；核糖核酸；脱核酵母
中图分类号：X791 文献标识码：A 文章编号：1009－2455（2003） 03－0047—03 Extradion of Ribonucleic Acid fFOm Fermentation Wastewater of Brewery
XU Ning，LI Zhi-fu，FENG Wen－hua
（School of Engineering Taishan Medical College，Taian 271000,China） Abstract:Spent yeast is the main pollutant in the wastewater from breweries. The recovery rates of ribonu-cleic acid and deribonucleic yeast from spent yeast ambient temperature using 10％ dilute brine are 3.3％～3.5％and 65.2％～66.5％respectively.After the pretreatment of the extract，the purity of the ribonucleic acid proauct exceeus 90%.Alter the extraction of ribonucleic acid and deribonucleic yeast，the BOD5，and CODcr of the wastewater decrease by 81％and 78％ respectively.
Key words：beer；fermentation; wastewater; ribonucleic acid; deribonucleic yeast 目前，我国年产量在 10×l04 t以上的啤酒厂有几十家，最小的年产量也在 10×103 t左右。这些厂遍布全国各地，生产中排出大量含有碳水化合物、蛋白质等物质的废水。据统计，每生产11啤酒约产出12—15 m3 的废水，当前全国啤酒年产量约为 2 ×l07t，每年产生大约 3×l08 m3 的废水。啤酒工业废水的污染指标因所在地区和生产工艺的不同而略有差异，但大部分ρ（CODcr）＞1500 mg/L，ρ（BOD5）＞1000 mg/L，ρ（SS）＞280 mg/L[1]。
啤酒废水中有机物主要来自酿造工序，如发酵过程中含有酵母残余物、废酵母的废水，其BOD5 的质量浓度高达 6800－13000 mg／L，约占整个废水BOD5的82％[2]，而其中的废酵母是主要污染物，1 g干酵母产生的 BOD5 约为 0.4 g[3]。因此，将这部分废水中的废酵母加以利用，提取核糖核酸并生产饲用脱核酵母，可变废为宝，同时，大大降低废水处理负荷。我们利用啤酒厂酿造工序废水中的酵母，通过盐析方法提取试验，回收高纯度、低浊度的核糖核酸，确定了可行的工艺条件。 l 原理 酵母中核糖核酸（RNA）的质量分数为 2.67％－10.0％，脱氧核糖核酸（DNA）的质量分数为0.03％－0.516％，其他真菌中RNA的质量分数为0.665％－28.5％，DNA的质量分数为0.15％－3.30％[4-5]。啤酒酵母中的核糖核酸大多与蛋白质结合成核蛋白，被包含在酵母细胞内，菌体外有一层坚韧的细胞壁。盐析法提取酵母中的核糖核酸是通过改变细胞的渗透压，利用其溶于水的特性使其溶解于水中，再通过调节pH值，将核糖核酸从溶液中沉淀出来，经分离、洗涤、干燥后得成品核糖核酸。
试验流程如图1所示。 2 试验原料和方法 2.1 原料
啤酒废酵母：来自啤酒厂酿造车间；食盐（市售）；盐酸、氯化钙、氢氧化钠（工业级）、无水乙醇（分析纯）；絮凝剂（工业用）。 
2.2 设备、仪器
带搅拌和换热装置的敞口反应器，板框压滤机、离心分离机、沉淀漕、真空干燥器、751 GW型分光光度计、PHS－gV酸度计。
2.3 分析方法
至今，市场上对核糖核酸产品质量还没有一个统一的标准，只是国际上一些公司常用的技术标准。一般包括RNA含量（纯度）、浊度、pH值等。RNA含量采用铝蓝比色法。水分采用重量法测定。浊度的分析方法通过透光率测定。
2.4 试验方法
整个实验采用正交试验法，以确定最佳工艺条件。每组试验基本步骤为：
①将当日排放的废酵母，用清水洗涤3～4次，沉淀 30～40 h后，除去上层清水，取样测定沉淀的水分。
②将水洗后含酵母20％－25％的原液加人反应器，按不同的浓度加人精制食盐，搅拌均匀后调节pH值，然后迅速升温至90℃，并在90～95℃下保温2～3 h。
③将盐析完成的物料冷却至50～55℃，加入适量絮凝剂，然后进行重相、轻相离心分离、洗涤。重相用于生产饲用脱核酵母。
④在分离出的清液中加人助凝剂和絮凝剂，控制适当的 pH值，沉淀后 2 h后进行分离。
⑤上步分离的清液冷却至 20℃以下，用 6mol／L的盐酸迅速把pH值调至2.0左右，并加入少量氯化钙，沉淀0.5 h后，去掉上清液，再离心分离。
⑥用pH为2.0左右的去离子水洗涤滤饼数次，除去残盐及水溶性杂质。
⑦用不同浓度的乙醇分别洗涤滤饼数次，以便除去醇溶性杂质和色素。
⑧过滤除去乙醇，并在55～60℃的真空干燥器中干燥，然后粉碎过80目筛得成品核糖核酸。 3 试验结果与讨论 3.1 核糖核酸的回收率
湿酵母含水75％～80％，每批试验投料为折干酵母 500 g。回收率数据如表 1。以干酵母为基准的回收率，核糖核酸的质量分数为3.3％～3.5％，脱核酵母的质量分数为65.2％～66.5％。
表1 回收率试验数据 |
| 序号 | 核糖核酸 | 脱核酵母 |
|
| 干重/g | 质量分数／％ | 回收率／％ | 干重/g | 回收率／％ |
| 1 | 18.6 | 91.2 | 3.4 | 331.0 | 66.2 | 2 | 18.1 | 91.2 | 3.3 | 332.5 | 66.5 | 3 | 18.2 | 90.9 | 3.3 | 331.5 | 66.3 | 4 | 18.7 | 91.0 | 3.4 | 327.0 | 65.4 | 5 | 19.3 | 90.7 | 3.5 | 326.0 | 65.2 | 6 | 18.2 | 90.5 | 3.3 | 327.5 | 65.5 | 7 | 19.4 | 90.2 | 3.5 | 329.5 | 65.9 | 8 | 19.4 | 90.1 | 3.5 | 328.5 | 65.7 | 平均 | | 90.7 | 3.4 | 328.5 | 65.8 |
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3.2 盐析的影响因素
影响盐析中核糖核酸回收率的主要因素有盐质量分数、溶液出值和升温速率。其中在溶液pH值6.0～7.0 时，盐质量分数影响结果如表 2 所示。
盐的质量分数在 9.0 ％～11.0 ％时，回收率可达3.4％以上；盐的质量分数在 7.0％～9.0 ％时，回收率为 3.0 ％～3.3％；当盐的质量分数低于 7.0％后，回收率大幅度下降。试验还表明，加盐后必须快速将溶液升温至90℃，尽可能缩短20～70℃之间的停留时间，减少磷酸二脂酶的降解率，提高核糖核酸的回收率。 表2 盐的质且分贝对核出核糖核酸回收率的影响 |
| 序号 | 溶液盐的质
量分数／％ | 核糖核酸 | 纯核糖核酸
回收率／％ |
|
| 干重/g | 质量分数／% | |
| 1 | 11.0 | 19.3 | 90.8 | 3.5 | 2 | 10.0 | 19.3 | 90.7 | 3.5 | 3 | 9.0 | 19.2 | 91.1 | 3.4 | 4 | 8.0 | 18.2 | 90.9 | 3.3 | 5 | 7.0 | 16.4 | 91.2 | 3.0 | 6 | 6.0 | 14.8 | 91.0 | 2.7 |
| | （pH=6.0～7.0.每批投料 500 g 折干酵母） |
3.3 抽取液的预处理
为获得低浊度的核糖核酸，对分离出的抽取液进行预处理是关键的一步。在盐析后、分离前加人适当的絮凝剂有利于轻、重相的离心分离，但投加量过多会影响洗涤效果，造成较大流失，影响回收率。经过筛选试验，采用聚丙烯酸钠做絮凝剂，用氯化亚铁作助凝剂，在 pH=6.0±0.5时，效果较好。沉降后的清液直接分离核糖核酸，产品的浊度仍然高于 26％，必须将其中悬浮的颗料进一步分离。试验中采用硅藻土过滤机进行过滤，使产品的浊度控制在17％～20％之间。
预处理主要除去的是微粒状悬浮物和部分自港蛋白质，要将大部分自溶蛋白质除去，还要进一步研究适当的工艺条件。
3.4 核糖核酸的分离
在常温条件下，将预处理后的抽取液，控制pH值为2.0左右即可沉淀出核糖核酸。与常用的低温法相比，回收率没有下降。加人0.5%～1.0％的氯化钙后，使沉淀时间由原来的 2h 以上缩短到0.5 h 以内，且沉淀效果明显好转，离心分离容易。
核糖核酸在稀碱或酸性条件下，都会产生不同程度的降解，只在低温酸性条件下比较稳定。所以，加入少量氯化钙促进沉淀，不但可以缩短常温下停留时间，而且可以减少降解损失。
3.5 对废水污染的控制效果
来自酿造工序的废水通过沉降、过滤分离后，所含废酵母的81％～84％被分离下来，试验所用几次废水水样分离前后的BOD5，CODcr，SS数据列于表3。分离酵母后，废水的BOD5，和CODcr分别下降80％和78％以上。 4 回收量分析 不同厂家酿造工序的废水量波动较大，一般含废酵母17～33 g／L，经沉降、过滤可分离出其中的81％以上。当核糖核酸回收率达到3.3％时，可从每升废水中回收0.6～1.1g 的核糖核酸，同时回收11.1～21.5 g 的脱核酵母。每公斤干酵母消耗食盐为 1 kg。洗涤用乙醇循环使用，但损耗较大，约为30％。 表3 分离酵母前后水样的分析结果 |
| 序号 | 分离前 | 分离后 |
|
| ρ（BOD5）／
（mg·L-1） | ρ（COD）／
（mg·L-1） | ρ（SS）／
（mg·L-1） |
ρ（BOD5）／
（mg·L-1）
| ρ（COD）／
（mg·L-1） | ρ（SS）／
（mg·L-1） |
| 1 | 10137 | 712 | 10180 | 1923 | 143 | 772 | 2 | 10950 | 691 | 11072 | 2061 | 137 | 593 | 3 | 12420 | 387 | 12561 | 2294 | 132 | 654 | 4 | 13017 | 578 | 13095 | 2407 | 110 | 815 | 5 | 12366 | 614 | 12505 | 2299 | 117 | 930 |
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5 结论 ①本工艺在常温下用淡盐提取核糖核酸，与常规的低温浓盐法相比，在保证较高回收率的前提下，缩短了生产周期，降低能耗。
②回收的核糖核酸产品纯度大于90％，浊度小于20％。
③用该方法提取核糖核酸，并同时回收脱核酵母后，酿造工序废水的BOD5 和CODcr 均有较大幅度的降低。 参考文献： [1] 管敦义.啤酒工业手册[M].北京：轻工业出版社，1998
[2] 大连轻工业学院，无锡轻工业学院.酿造酒工艺[M].北京：轻工业出版社，1992.
[3] 张永明，俞俊棠，王建龙.处理啤酒洗槽废水同时生产单细胞蛋白[J].环境科学，2000，21（3）：97－99.
[4] 中国科学院微生物研究所.微生物在工业上的应用[M].北京：科学出版社，1971.
[5] Rehm H J.Industrielle Mikrobiogie[M].New York：Springer－Verlag Berlin，Heidelberg，1967.
作者简介：许宁（1961－），男，江苏南京人，高级工程师，从事水污染控制工程的研究与教学工作，电话（0538）8513255。 | 
