聚合酶链式反应在微生物检测中的应用

马 军， 邱立平， 冯 琦
( 哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江哈尔滨1500 90)

　　 摘 要： 综述了聚合酶链式反应(PCR技术)的原理、方法及其研究进展，介绍了PCR及其相关技术在水体微生物检测中的优势和应用研究现状，分析了该技术在水体微生物检测中存在的问题及解决方法。PCR技术的应用将极大地提高水体微生物检测速度、灵敏度和准确度，对于评价水处理过程中细菌、病毒、病原原生生物等的去除效率也将具有重要意义。
　　关键词： PCR； DNA； 水体微生物； 检测
　　中图分类号：X832
　　文献标识码：B
　　文章编号： 1000-4602(2002)01-0034-03

1 PCR技术及其发展

　　PCR技术最早于1985年由美国人类基因学会(ASHG)年会在DNA片段扩增工作的研究中得以描述，由此开始在各个相关领域得到了迅速而广泛的研究，现已成为一个世界性的前沿课题。
　　PCR是一种具有选择性的体外DNA或RNA扩增方法。通过选择某一特定微生物物种的一段特异性基因区域(即所谓“目标序列”)进行体外扩增，再由凝胶电泳等DNA分析技术确定其种类及含量。PCR技术的特异性是由人工合成的引物DNA序列确定的。所谓引物是指与待扩增核酸 片段两端互补的寡核苷酸，即ssDNA(单链DNA)。PCR反应包括目标DNA序列的加热变性、引物退火复性和在DNA聚合酶作用下的引物延伸三个阶段。其做法为：环境水样中微生物经预处 理后取得DNA样板，在变性温度下DNA变性解旋；在复性温度下两引物分别与两条DNA的两端 互补性结合，此时引物的3′端相对，5′端相背，称引物与模板的杂交；在延伸温度和适当 的pH值及离子强度下，由TaqDNA聚合酶催化引物引导的DNA由5′端向3′端延伸，从而完成一个变性—复性—延伸的PCR循环。通过不断的PCR循环，可以使扩增DNA产量呈上升指数， 达到体外扩增特定DNA序列的目的。
　　最先利用PCR技术扩增而出的DNA序列是人的β—球蛋白基因［1］，并在1987年6月首次临床应用。有关DNA提取、引物设计、反应温度、扩增产物的分析技术等方面的研究成果逐 渐增多，已相继建立了套式PCR(nested PCR)、半巢式PCR(semi-nested PC R)、反向(逆转录)PCR(reverse transcriptase-mediated PCR)、竞争性PCR(competitive P CR)等技术方法。PCR技术在已进行的微生物检测研究中充分显示了其快速、灵敏的优点，如Niederhauser等人［2］利用PCR技术检测食品中的单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytoge nes)只需32～56 h，而传统方法为10d。

2 在水体微生物检测中的应用

　　目前PCR技术应用于水体微生物检测研究的重点是给水的微生物检测，尤其是近年来引起人们广泛关注的病原微生物，诸如军团菌(Legionella pneumophila)、贾第虫(Giardia)、隐孢子虫(Cryptosporidium)及一些肠道病毒等的PCR检测方法研究。研究的内容包括DNA物质提取方法的改进、样品中PCR抑制物的去除、PCR方法的改进与比较、扩增产物的分析技术等。
2.1 供水卫生学安全检测
　　最早的水体细菌学检验始于1885年，流行病学的证据表明［1］，在过去的60年中工业化国家由水媒病原微生物所引起的爆发性流行病发病率已有了明显的下降，这其中供水的卫生学检验功不可没。
　　与传统方法相比，PCR方法不仅检测时间短、灵敏度高，还可以检出一些依靠培养法不能检测的微生物种类。PCR方法已在粪便污染指示菌及病原细菌［3］、病毒［4］ 、军团菌和病原原生生物［5～7］等的检测中有了比较深入而广泛的研究，取得了较好的应用成果。如Zehr等［8］利用PCR技术直接从海水DNA样品中特异性地扩增一种目前常规方法无法培养的Trichodesmium thiebautii菌株的固氮基因(nif)片段。Catalan等［9、10］分别检测了污水和饮用水中军团菌污染情况。对于生物污染严重的污水中的军团菌用常规的分离培养法不可能检出，而用套式PCR方法则可极其准确地检出，检测时间仅为4h,而用培养法检测饮用水中的军团菌需7～10 d。Catalan等还进行了肠道病毒 的PCR方法检测研究，发现PCR法不仅可将检测时间从培养法的3～4周缩短到8h，还大大地提高了灵敏度和选择性。Fricker等［1］报道的一种用于检测病毒的PCR新方法可在24h内得到测定结果，并且极其灵敏。他们开创的一种基于PCR的E.coli.检测方法可以在2 4 h内完成对99种不同的环境水样检测，取得了与标准方法100%吻合的检测结果，该方法已列为泰晤士河的例行检测项目。Hallier-Soulier等［5］利用免疫磁分离PCR技术 检测饮用水中Cryptosporidium parvum卵囊虫的灵敏度达到了可以在5～100 L水样中检出一个虫体。Heiber等［11］利用与核酸探针技术结合的PCR方法检测粪便污染指示菌，有效地排除了一些抑制物的干扰，可以对E.coli等进行快速测定。一些学者还进行了多个引物同时应用的尝试［12］，以期提高检测效率。近一时期，基于PCR技术的16SrD NA检定技术等也在水体微生物检测领域被广泛研究［13］。
2.2 废水生物处理过程的监测与评价
　　常规检测方法受采样及分析条件的影响极大，结果准确性差，检测时间长，并且有些种类( 如厌氧菌)分离困难，而PCR技术不仅克服了这些缺点，还为一些生物参数应用于水处理工艺的自动控制提供了可能。由于水处理过程中生物氧化作用是由多菌种共同作用的结果，因此各不同菌群之间的相互作用至关重要。由PCR技术发展而带动的基于多态性技术在微生物生态系的研究取得了迅速进展，如DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)技术、RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA)技术都可以检测各种生物反应器中的微生物种群结构。Selvaratnam等人［14］用编码苯酚单加氧酶dmpN基因的RT—PCR技术 来检测处理废水的SBR反应器中降解酚的假单胞菌。结果表明，RT—PCR方法不仅能检测出微生物降解酚的能力，还能测量出dmpN基因的转录水平，从而确定该假单胞菌特殊的分解活性，而且发现在转录水平条件下，酚浓度与通气时间之间存在正相关关系。Ferris等人［14］用DGGE分析16SrDNA基因的扩增产物来绘制一组微生物种群的16SrDNA基因图谱。RA PD(randomly amplified polymorphic DNA)技术也是应用比较广泛的一种以多态性引物来扩 增某些片段的技术。RAPD分析用于检测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中的微生物多样性。用RAPD分析所得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试和中试规模的反应器方面是有用的，但还不足以用来估测群落的生物多样性。用RAPD分析检测 实验室规模的油性淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤泥改良过的培养料比未经改良的更适合于不同的微生物种群生长。Vainio等人^［14］将从516种孤立的菌落中提取出的16SrDNA经PCR扩增后进行测序来检测活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的应用大大增强了对微生物的检测和鉴定能力，从而为理论研究工艺优化及生物处理效率的提高提供了条件。
2.3 存在的问题及解决方法
　　① PCR反应能够被自然界中一些物质所显著抑制，例如胡敏酸、富里酸、某些离子及糖类 物质等可以干扰Taq聚合酶的作用。同样，环境水样在浓缩、保存和提纯过程中可能从环境 及中间处理环节带来一些潜在的PCR反应抑制剂，例如EDTA、十二烷基硫酸钠和一些胍基化合物等，另外还可能有一 些共存物质可能抑制PCR反应。这些抑制剂一方面可能抑制PCR反应；另一方面还可能造成 假阳性结果。因此，研究环境样品中待扩增DNA或RNA的提纯技术以消除抑制物的影响［9、15］是十分重要的。对水体样品的提纯比其他环境水样相对容易些，这也为PCR技术在水体检验中的广泛应用提供了有利条件。
　　② 检测对象的生物活性。由于DNA的检测并不意味着必须使用活细胞，从理论上讲任何可以提供核酸物质的样品都可以进行PCR扩增，这就是说PCR技术不能区分活细胞和死细胞，尤其是在水体卫生学检验中不能确定所检出的病毒粒子是否具有感染能力，这是一个待解决的问题。如果扩增mRNA的技术取得突破也许会对解决这个问题提供很大的帮助，这在一定程度上取决于使用什么样的引物。Fricker等［1］认为rRNA扩增及现场杂交技术来鉴定细菌和原生生物活性的方法，其有效性尚待在环境样品的实际检验中证明。
　　PCR技术的不足会逐渐得到改进，但全面将其作为标准方法来使用尚需做很多工作。

3 结语

　　PCR技术为水工业技术研究及评价提供了快速、方便的检测手段，对于保障安全供水、促进废水生物处理工艺研究有着重要意义。PCR技术具有快速、灵敏、准确和简便等特点，有传统方法无可比拟的优势。PCR及其相关技术的研究应用和不断推广必将提高水体微生物的检测水平，促进水工业的发展。

参考文献：

　　［1］ Fricker E J,Murrin K,Fricker C R.The use of PCR for the detection of bacteria an d viruses［J］.Water Supply，2000,17(2):5-16.
　　［2］ Niederhauser C U,Candian C,Hofelein M,et al.Use of polymerase chain reaction for detection of listeria monocytogenes in food［J］.Appl Environ Microbiol，19 92,58(5):1564-1568.
　　［3］ Bej A K,Steffan R J,DiCesare J，et al.Detection of coliform bacteria in wate r by polymerase chain reaction and gene probs［J］.Appl Environ Microbiol，1990, 56(2):307-314.
　　［4］ Abbaszadegan M,Huber M S,Gerba C P,et al.Detection of enteroviruses in groun dwater with polymerase chain reaction［J］.Appl Environ Microbiol，1993,59(5):13 18-1324.
　　［5］ Hallier-Soulier S,Guillot E.Immunomagnetic separation-PCR for ultra-sensitive an d specific detection of Cryptosporidium parvum oocysts from drinking water sampl es［J］.Water Supply，2000,17(2):45-47.
　　［6］ Stinear T,Matusan A,Hines K,et al.Detection of a single viable Cryptosporidi um parvum oocysts in environmental concentrates by reverse transcription-PCR［J ］.Appl Environ Microbiol，1996,62(10):3385-3390.
　　［7］ Rochlle P A,Ferguson D M,Handojo T J,et al.Development of a rapid detection procedure for Cryptosporidium using in vitro cell culture combined with PCR［J］ .Journal of Eukaryotic Microbiology，1996,43(1):72-79.
　　［8］ Zehr J P,McReynolds L A.Use of degenerate oligonucleotides for amp lification of the nifH gene from the marine cyanobacterium trichodesmium thiebau tii［J］.Appl Environ Microbiol，1989,55(10):2522-2526.
　　［9］ Catalan V,Moreno C,Dasi M A，et al.Nested polymerase chain reaction for dete ction of Legionella pneumophila in water［J］.Research in Microbiology，1994,145 (3):603-610.
　　［10］ Catalan V,Garcia F,Moreno C，et al.Detection of Legionella pneumophila in wa stewater by nested polymerase chain reaction［J］.Research in Microbiology，1997 ,148(1):71-78.
　　［11］ Heiber I,Frahm E,Obst U.Molecular biological detection of hygienically relevant microorganisms in water samples based on specific nucleic acid probes and magnet ic beads［J］.Water Supply，1999,17(2):1-3.
　　［12］ Bej A K,Mahbubani M H,Miller R，et al.Multiplex PCR amplification and immobi lized capture probes for detection of bacterial pathogens and indicators in wate r［J］.Molecular Cell Probes，1990,4(2):353-365.
　　［13］ Jensen M A,Webster J A,Strauss N. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms［J］. Appl Environ Microbiol，1993,59(3):945-952.
　　［14］ 岳春梅,明镇寰.分子生物学技术在环境微生物监测中的应用［J］.微生物学通报，2000,27( 2):215-218.
　　［15］ Tasai Y L,Olson B H.Rapid method for separation of bacterial DNA from humic subs tances in sediments for polymerase chain reaction［J］.Appl Environ Microbiol， 1992,58(7):2292-2295.

　　电　话：(0451)6282292
　　传　真：(0451)2368074
　　E-mail:[email protected]
　　收稿日期：2001-10-30