高效降解原油细菌的筛选和处理效果

金文标1， 王宝贞1， 宋莉晖2?
( 1.哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江哈尔滨150090；2.中国石油勘探开发研究院廊坊分院，河北廊坊065007)

　　摘 要：用常规功能菌筛选和诱变方法获得了5株高效降解原油菌，通过试验确定其适宜降解条件：废水初始pH值为5.5～7.0、温度为25～35℃、溶解氧为5.5～7.0mg/L。将此菌接种到三相流化床中，在适宜降解条件下可使废水中的油含量从44.4mg/L降至4.0mg/L，平均去除率为91.0%。?
　　关键词： 原油废水；三相流化床；筛选；诱变?
　　中图分类号：X703.1
　　文献标识码：C
　　文章编号：1000-4602(2002)03-0051-03

1 菌株筛选

1.1 筛选方法
　　高效降解原油菌遵循一般功能菌筛选的基本原则^［1］，但培养基组成、菌株处理方式、菌种性能测定方法、菌投加量等技术问题需要通过试验确定。?
　　① 采集菌样
　　由于筛选出的高效降解原油菌将用于含油废水处理，故采集的含菌样品为油污土壤和含油废水。
　　② 富集培养
　　采用的富集培养基成分为：K₂HPO₄·3H₂O为1g/L、KH₂PO₄·3H₂O为1g/L、Na₂HPO₂·3H₂O为1g/L、NaCl为0.5g/L、MgSO₄·7H₂O为0.05g/L、原油为10g/L。
　　③ 纯种分离
　　通过纯种分离，可把退化菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经过扩大培养就可恢复菌株的典型性状。采用较粗放的平板分离方法能达到“菌落纯”的水平。平板培养基组成：牛肉膏为3g/L、蛋白胨为10g/L、NaCl为5g/L琼脂为15g/L、pH为7.0。分离后需通过显微镜观察并作纯种验证。
　　④ 性能测定
　　分离后获得纯种是筛选工作的第一步，要想得到较为理想的生产和科研用菌，还需进行一系列的测试、比较，筛选出性能稳定、适应范围宽、符合生产要求的高效菌株。
1.2 筛选结果
　　将纯种分离获得的40株降解原油菌分别接种到40份含油废水(含有营养物质)中于30℃下摇动培养。
　　因为菌体是不透光的，液体中细菌数量与吸光度成正比，因此在比浊测定中菌株的吸光度大，说明其繁殖得好，即利用原油的能力强，故被认为是相对高效的降解原油菌。经初筛，获得10株相对高效的降解原油菌株(见表1)。
　　将初筛获得的10株相对高效降解原油菌经增殖培养后分离出菌泥，分别接种到含原油废水中(含营养物)，摇动处理12h，静置沉淀并测定上清液的油含量(用石油醚做萃取剂，采用紫外分光光度法)。除油率结果列于表2。
　　通过对菌株降解原油性能的测定，确定了4株高效降解原油菌：3、9、12、14。

表1 原油降解菌生长状况测定结果 菌株编号 吸光度 相对高效菌 菌株编号 吸光度 相对高效菌 第一组 第二组 第一组 第二组 1 0.089 0.088 21 0.098 0.078 2 0.050 0.076 22 0.086 0.056 3 0.169 0.179 + 23 0.068 0.050 4 0.109 0.099 24 0.070 0.061 5 0.086 0.076 25 0.198 0.176 + 6 0.085 0.060 26 0.056 0.066 7 0.100 0.098 27 0.096 0.100 8 0.099 0.071 28 0.056 0.062 9 0.148 0.167 + 29 0.050 0.056 10 0.099 0.101 30 0.105 0.099 11 0.059 0.088 31 0.110 0.130 + 12 0.125 0.134 + 32 0.059 0.100 13 0.137 0.148 + 33 0.061 0.077 14 0.122 0.121 + 34 0.098 0.089 15 0.145 0.164 + 35 0.070 0.064 16 0.096 0.100 36 0.061 0.065 17 0.097 0.087 37 0.199 0.176 + 18 0.078 0.056 38 0.102 0.098 19 0.056 0.076 39 0.110 0.131 + 20 0.055 0.050 40 0.091 0.078 注：对照试验的第一组吸光度值为0.050，第二组吸光度值为0.049。

表2 原油降解菌除油性能测定结果 菌株编号 第一组 第二组 残油量(mg/L) 除油率(%) 残油量(mg/L) 除油率(%) 3 3.05 83.4 3.12 83.1 9 2.94 84.0 3.00 83.7 12 3.56 80.7 3.47 81.2 13 7.10 61.5 6.90 62.5 14 5.44 70.5 4.31 76.6 15 9.51 48.4 9.09 50.7 25 8.04 56.4 8.45 54.1 31 10.02 45.6 9.86 46.5 37 5.97 67.6 5.80 68.5 39 9.94 46.0 10.12 45.1 对照 18.42 19.01

2 　菌株诱变

2.1 诱变方法
　　为进一步提高细菌降解原油的性能，对筛选出的4株菌以硫酸二乙酯为诱变剂进行常规诱变。
2.2 　诱变结果
　　试验获得了6株诱变菌，诱变前后细菌的除油性能对比结果见表3。

表3 诱变前后细菌除油性能比较 菌株编号 第一组 第二组 残油量(mg/L) 除油率(%) 残油量(mg/L) 除油率(%) 3 3.15 84.3 3.23 　85.4 3y1 4.15 79.4 5.03 77.2 3y2 3.01 85.0 3.19 85.6 9 3.04 84.5 3.12 85.9 9y1 3.00 85.1 3.04 86.2 9y2 3.28 83.7 3.45 84.4 12 3.78 81.2 3.90 82.4 12y 3.66 81.8 3.71 83.2 14 4.54 77.4 4.31 80.5 14y 3.02 85.0 3.09 86.0

对照

20.12 22.10

　　通过原菌和诱变菌的除油性能对比试验，获得了5株高效降解原油菌，分别是：3、3y2、9、9y1、14y。?
　　对这5株高效降解原油菌进行初步分类鉴定，结果见表4。

表4 初步鉴定结果 菌株编号 菌落颜色 显微镜观察 初步鉴定结果 3 清白色 杆状 芽孢杆菌属 3y2 浅黄色 长粗杆状 芽孢杆菌属 9 黄白色 短杆状 黄杆菌属 9y1 黄色 短杆状 黄杆菌属 14y 乳白色 球状 假单胞菌属

3 　处理效果及影响因素

3.1 试验方法
　　将经筛选、诱变获得的5株菌分别接种于牛肉膏—蛋白胨培养基，培养后离心分离获得菌泥，将菌泥按相同比例混合后投入含原油废水中，采用摇动培养，考察pH值、溶解氧、温度等因素对处理效果的影响。?
　　测定pH值用玻璃电极法，测定溶解氧用膜电极法，测定油含量用紫外分光光度法^［2］。?
3.2 结果与讨论
　　① pH值?
　　当废水油含量为35.42mg/L、处理温度为30℃、摇床转速为200r/min、投菌量为5g(湿重)/L时，在不同pH值下处理12h及24h后发现，pH值为5.5～7.0时能有效地降解废水中的原油，且随着处理时间的延长，除油率增大。当处理时间为12h时除油率为42%～57%；当处理时间为24h时除油率达70%～78%。当pH＜5.0或＞9.0时除油率迅速降低，这是因为随着pH值的变化，酶分子上的酸性及碱性氨基酸侧链基团处于不同的解离状态，具有催化活性的基团在总酶量中的比例不同使得酶分子的催化能力也不一样^［3］。H值在5.5～7.0时，总酶量中活性基团的比例大，酶分子的催化能力强，细菌对原油的降解能力也强。?
　　② 温度?
　　在废水油含量为35.42mg/L、pH值为6.5、摇床转速为200r/min、投菌量为5g(湿重)/L的条件下，处理12h及24h后分别测定除油率，结果发现菌的适宜降解温度为25～35℃。在此范围内微生物繁殖速率快,24h后除油率可达70%左右，并以30℃时除油效果最佳(除油率达78.5%)。之后再升高温度，除油率反而略有降低(37℃时测得除油率仅为57.5%)。另外，低温对原油降解也不利，当温度为20℃时除油效果明显下降，这是因为低温时部分细菌进入内源呼吸期，开始代谢自身细胞内的营养物质，细菌的生长、繁殖速率放缓，导致除油效率下降^［4］。?
　　③ 溶解氧
　　在初始油含量为35.42mg/L、pH值为6.5、环境温度为30℃、投菌量为5g(湿重)/L时，调节摇床转速以考察溶解氧量对除油效果的影响(溶解氧与转速的关系见表5)，结果发现随溶解氧量的增加原油降解率迅速增加，当DO为6.29mg/L时，除油效率达到80%左右，此后再增大溶解氧量，除油效率增幅不大。这是因为在该试验条件下菌体能均匀地悬浮于水中，对营养物质的吸收及代谢物的分散都非常有利，氧在生物相间的传质阻力也可忽略，生化反应控制步骤仅取决于氧在气—液间的传质速率。随着摇床转速增大，引起水中溶解氧量不断增加，气膜和液膜的厚度减小，气—液相的接触比表面积增大，氧传递阻力减少，氧传质速率提高，原油降解速率增大；当DO为6.29mg/L时，氧传质速率与原油降解率相匹配，达到了一个动态的平衡过程。此后，当溶解氧继续增高时，整个反应过程受菌体自身生长及代谢速率制约，导致总降解速度增加缓慢。

表5 溶解氧与转速的关系30℃ 转速(r/min) 0 60 100 100 140 180 260 溶解氧(mg/L) 0.65 3.72 5.10 5.71 5.71 6.29 7.23

4 三相流化床处理含原油废水

　　三相流化床采用体积质量＞1的细小惰性颗粒活性炭作悬浮填料，采用体积质量＜1的树脂球作漂浮填料，再接种高效降解原油菌，使其生长于这些载体表面形成生物膜，通过曝气使废水自下向上流动，使载体处于流化状态，其上附着的生物膜可与废水充分接触。在温度为30℃、pH值为6.5、停留时间为2～3h、流量为2～3L/h条件下处理含油废水，运行稳定后2h取样分析1次，处理结果见表6。

表6 三相流化床处理效果 样品编号 流量(L/h) 进口油含量(mg/L) 出口油含量(mg/L) 除油率(%) 1 2.2 42.1 3.7 91.2 2 2.4 42.6 4.5 89.4 3 2.6 41.6 3.5 91.6 4 2.7 41.9 4.2 90.0 5 2.7 59.0 4.9 91.7 6 2.9 41.1 3.5 91.5 7 3.0 42.8 3.8 91.1

　　由表6可见，三相流化床的除油率均在90%左右，因此将高效降解原油菌与高效处理构筑物组合能获得良好的处理效果。?

5 结论

　　① 经筛选和诱变获得的芽孢杆菌属、黄杆菌属、假单胞菌属等5株菌是高效降解原油菌，其对原油的适宜降解条件为废水初始pH值为5.5～7.0、处理温度为25～35℃、溶解氧为5.7～7.2mg/L。?
　　② 高效降解原油菌与三相流化床组合可使废水中的原油含量由进口的44.4mg/L降至出口的4.0mg/L，平均去除率为91.0%，达到了排放标准。

参考文献：

　　［1］杜连祥.工业微生物学实验技术［M］.天津：天津科学技术出版社，1992.
　　［2］国家环境保护局.水和废水监测分析方法［M］.北京：中国环境科学出版社 ，1989.
　　［3］K Chin Kee.Evaluation of treatment efficiency of processes for petroleum refinery wastewater［J］Water Science and Technology,1994,29(8):47-50.
　　［4］Kettunen Riitta H,Pulkkinen Esa M,Rintala Jukka A.Biological treament at low tem peratures of sulfur-rich phenols containing oil shale ash leachate［J］.Water Re search,1996,30(6):1305-1312.

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　　收稿日期：2001-12-25