固相萃取-LC-MS法检测环境中痕量雌激素

常红1 胡建英1* 邵兵1,2 杨敏2
1.北京大学城市与环境学系，北京，100871；2.中国科学院生态环境研究中心

　　近年的研究表明许多化学物质干扰人类及野生动物的内分泌系统,导致男性精子数减少,野生生物生殖机能和生殖器官发育出现异常现象。在这类物质中,人工合成及自然雌激素是一类比较重要的化学物质[1]。
　　由于我国是当今世界上避孕药生产和销售量最大的国家之一，而合成雌激素是避孕药的主要成分；同时，我国的城市污水处理率普遍较低，因此从污染水平看，我国存在来自人类，家畜的自然雌激素和人工合成激素的污染较其他发达国家高的污染特征。由于雌激素类物质在极低浓度条件下显示出强的内分泌干扰作用，而且有可能和水体中残留的其他类雌激素物质发生协同作用，因此这类物质对生态环境潜在的危害性是不可忽视的。
　　目前用于监测环境中痕量雌激素的方法是衍生-GC/MS法[2]。由于衍生-GC/MS法操作繁杂，衍生率变化大等原因，实际应用起来比较困难.Maria[3]等建立了几种典型的雌激素的LC/MS分析法，但到目前为止仅仅停留在标准样品的检测，应用到环境中痕量雌激素分析还有待进一步的完善。
　　本研究选择了在我国生产产量比较大的3种合成雌激素，己烷雌酚（DES）、戊酸雌二醇(EV)、炔雌醇(EE)；3种自然雌激素,雌二醇(E2)、雌酮(E1)和雌三醇(E3)和双酚A(BPA)，建立了用于以环境调查的固相萃取(SPE)-LC-MS联用方法。

1. 实验部分

　　1.1仪器
　　Waters 2690 Separations Module-Miromass ZMD液质-联用系统, SPS 24固相萃取（SPE）装置（Varian公司）。
　　1.2试剂、标准品及材料
　　本试验的对象物质的结构如图-1所示。雌二醇、雌三醇、雌酮，双酚A、己烷雌酚、戊酸雌二醇、炔雌醇，均来自日本和光公司；纯水（电导率，18.1Ω.cm-1）；乙氰、甲醇都为HPLC级（Fisher公司）；StrataTMC-18-E 固相萃取柱（500mg/6ml）。
　　1.3样品前处理
　　取500ml水样，滤纸过滤后用固相萃取柱进行浓缩。柱活化条件：6ml 乙氰，6ml甲醇，6ml超纯水。上样速度：3-5ml/min。洗脱条件：10ml乙氰。洗脱液在微弱氮气下吹干，用乙氰定容至0.5ml。
　　1.4 LC-MS分析条件
　　本文用Waters Xterra MS C18（2.1×150mm）色谱柱分离分析对象物质。流动相A：超纯水，流动相B：乙氰。采用梯度淋洗，梯度条件：在15min内流动相B从10%线性变化到50%， 然后保持到25min不变，然后在5min内流动相B从50% 增加至100%,保持5min不变。
　　质谱条件：去溶剂气流量500 l/h，去溶剂温度400°C，锥孔气流量100 l/h，离子源的温度100°C，喷雾毛细管电压2.0KV。

2. 结果与讨论

　　2.1 质谱条件的优化
　　为了得到最大的灵敏度，首先，对可能影响质谱灵敏度的的各种条件进行了优化，发现离子源的锥孔电压对灵敏度影响较大。图-2为7种对象物质在不同锥孔电压下的响应曲线。从图可知，各对象物质在最大灵敏度响应时的锥孔电压(V)有很大的不同，获得最高灵敏度时的锥孔电压分别为E1（50 ）、E2（60）、E3（60）、BPA（30）、EV（50）、HEXO（30）、EE（50）。
　　2.2 色谱分离及定量

表-1 7种物质的性质、回收率和检测限 物质 分子量 logPow LC-MS
LOD(μg/l) 回收率(%) E1 270 3.69 0.4 87.6 E2 272 4.13 0.2 78.2 E3 288 2.94 6.2 73.1

　　如图1和表1所示，对象物质具有非常相似的结构和物理性质。为了有效地分离具有相似性质的对象物质，本试验采用了流动相组分梯度的方法。图-3为7种化合物的标准混合物的LC-MS色谱图。除E2和BPA以外,其他物质得到了很好的分离。E2和BPA的分离根据分子量的不同用MS分离后定量。各物质的定量采用外标法。结果表明各种物质的浓度-响应值具有较好的线形关系（r2>0.999）。
　　2.3 固相萃取的回收率
　　由于这几种雌激素物质的浓度在环境中非常低，所以必须建立一个高效的浓缩方法。常用的固相萃取柱填料有C-18、高分子以及石墨化碳黑（GCB）等。考虑到低浓度测定时，尽可能减少杂质峰的影响，本文选用了吸附性相对较低的C-18作为浓缩用固相萃取柱,并对不同添加浓度条件下的回收效果进行了评价。图-4表示标准添加浓度为0.18μg/l时的LC-MS色谱图。各物质的回收率如表-1所示。E1、E2、BPA、DES的回收率都高于80%，EV的回收率偏低，为60%。从表的logPow看，造成EV回收率低的原因可能是由于它的极性较低，而没有完全从固相柱上洗脱下来，还有待于进一步改善。
　　2.4 检测限
　　这7种对象物质的仪器检测限（S/N=3）如表-1所示。E1、E2、BPA具有较低的仪器检测下限。考虑到方法的浓缩倍数和各物质的回收率，各物质的方法检测限如表1所示。结果表明本方法可以测定环境中纳克每升浓度的对象物质。

3．结论

　　本文建立了一种能够同时检测环境水平的合成和自然雌激素的SPE-LC-MS方法。今后，计划利用此法检测这类物质在环境中的浓度水平，研究它们的环境化学行为。

参考文献：

　　[1] Purdom, C.E.；Hardiman, P.A.；Bye, B.J.；Eno, N. C.；Tyler, C.R.；Sumper, J. P. Chem. Ecol. 1994, 8, 275-285.
　　[2] D. Jahr, Chromatographia. 1998, 47, 49.
　　[3] Maria J. Lopez de Alda；Damia Barcelo. Journal of Chromatography A. 2000, 892, 391-406.

---

国家杰出青年科学基金(49925103)和国家自然科学基金委员会创新研究群体科学基金(40024101)资助

通讯联系人：[email protected]